微型化三光子显微镜小鼠佩戴实物图

01、微型化三光子显微镜突破成像深度极限

海马体位于大脑皮层和胼胝体下面，在记忆巩固、空间记忆和情绪编码等方面起重要作用。但由于大脑组织特别是胼胝体对传播光束具有高散射特性，突破胼胝体实现大脑深层直接成像成为长期以来神经科学家面临的极大挑战。此前，国际上已知的微型化多光子显微镜均无法实现穿透全皮层直接对海马体进行无损成像。

此次新研制的微型化三光子显微镜一举突破了此前的成像深度极限：显微镜激发光路可穿透小鼠大脑皮层和胼胝体，实现对小鼠海马CA1亚区的直接观测记录，神经元钙信号最大成像深度可达1.2毫米，血管成像深度可达1.4毫米。

使用微型三光子显微镜拍摄的头部固定小鼠大脑皮层、白质和海马CA1区的神经元结构和功能图像

小鼠自由运动时，使用微型三光子显微镜拍摄的海马CA1区神经元活动的100分钟连续记录

02、全新的光学构型设计

这一成像深度的突破得益于该显微镜全新的光学构型设计，使散射荧光收集效率实现了成倍提升。此外，该显微镜还可长时间、不间断地观测神经元功能活动而不产生明显的光漂白与光损伤。

微型化三光子显微镜光学构型

03、生物应用

利用该显微镜，团队研究了小鼠大脑顶叶皮层第六层神经元在抓取糖豆过程中的编码机制，发现约37%的神经元在抓取动作之前就开始活跃且在抓取时最活跃，约5.6%的神经元在抓取动作后开始活跃。

“这显示出不同神经元参与了不同阶段的编码，也初步展示了微型化三光子显微镜在脑科学研究中的应用潜力。”程和平表示，这一成像技术为人类更深入探寻大脑的奥秘、揭秘脑功能连接图谱提供了重要工具。

04、国际影响力

2023年3月3日，Nature Methods期刊邀请Benjamin F. Grewe等领域专家发表在线社评文章Deep brain imaging on the move1，特别指出近期程和平团队所开发的微型化三光子显微镜对于深脑成像的重要意义。

Grewe等人系统对比了用于自由行为小鼠大脑功能成像的微型化显微镜技术。文中指出，对于大脑深部区域的成像，微型化多光子显微镜相比微型化单光子显微镜具有多种优势，例如改进的光学切片和减少背景污染等方面。由于血管和脑组织在可见光、远红光和红外波长下具有不同的光吸收和散射特性，在较高成像深度下多光子显微镜可有效改善成像中的光散射现象。其次，单光子显微镜在成像过程中激发了显著的背景荧光，与此相比，多光子显微镜的非线性吸收特性大大降低了成像焦面以外的荧光激发。尽管在更高的成像深度和激光强度下，双光子显微镜也会受到部分背景荧光污染，但新开发的三光子显微镜可极显著地消除这种成像焦面以外的荧光激发。

微型化单光子/双光子/三光子显微镜技术对比

文章指出，尽管具有相似的轻微重量，现有的微型化单光子显微镜仅可成像大约100-200μm深度的神经元；双光子成像在大约500-600μm深度处，成像质量开始受到一定限制；三光子成像则将可到达的成像深度大大扩展至1,500μm。因此，在小鼠中，微型化三光子显微镜将直接实现对整个大脑皮层及下方区域，例如海马CA1进行成像，同时保留完整的大脑皮层结构投影。随着该新型微型化三光子显微镜的出现，神经科学的研究人员将可实现对例如涉及纹状体结构的，大脑皮层及皮层下方脑区之间的神经网络进行深入研究。

背景

2017年，程和平院士团队成功研制第一代微型化双光子显微镜，获取了小鼠在自由行为过程中大脑皮层神经元和神经突触活动的动态图像。2021年，团队研制的第二代微型化双光子显微镜将成像视野扩大了7.8倍，具备获取大脑皮层上千个神经元功能信号的三维成像能力。